應(yīng)如何正確溶解重組蛋白產(chǎn)品？
第1步：開(kāi)蓋前離心試劑管。凍干粉在運(yùn)輸過(guò)程中可能會(huì)因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開(kāi)塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過(guò)離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉*溶解。一般需要3000-3500rpm離心5min，效果良好。
第2步：用無(wú)菌水重懸至0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。這個(gè)步驟即為溶解步驟，非常重要。
1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉。蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強(qiáng)度。產(chǎn)品說(shuō)明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白*溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強(qiáng)度與說(shuō)明書中所標(biāo)明的不符，很多時(shí)候會(huì)造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能*溶解或者根本無(wú)法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。
2) 一定要溶解到的濃度。蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個(gè)范圍就是說(shuō)明書上所標(biāo)明的濃度范圍，一般為0.1-1.0 mg/ml。但這一濃度范圍對(duì)于不同的重組蛋白是不同的。高于或低于該濃度范圍時(shí)細(xì)胞因子或蛋白會(huì)不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì)超過(guò)該蛋白的大溶解濃度，即蛋白無(wú)法*溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚集(aggregation)，終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。
3) 一定不能振蕩(vortex)。這里所說(shuō)的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。請(qǐng)用放至室溫的緩沖液作為溶劑。加緩沖液后，蓋好瓶塞，輕輕用手翻轉(zhuǎn)瓶子或把瓶子放在一個(gè)緩慢搖擺的搖床上。這樣做來(lái)保證緩沖液能夠接觸到瓶子的整個(gè)內(nèi)壁。 讓瓶子在室溫放置至少10 - 15分鐘，然后可以進(jìn)行分裝或使用。
第3步：該重懸液在2-8℃長(zhǎng)可保存1周。
用說(shuō)明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在2-8℃，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細(xì)胞因子或重組蛋白的活性長(zhǎng)可保持1周。這對(duì)一個(gè)周期為5-7天的實(shí)驗(yàn)，如DC(樹(shù)突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。
其實(shí)，說(shuō)明書上推薦的濃度對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)來(lái)講是比較高的。所以用戶通常會(huì)將該溶液進(jìn)一步稀釋后再放在4℃保存，待1周內(nèi)用完。如進(jìn)行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進(jìn)行稀釋，否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易會(huì)粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降，細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。
第4步：如要長(zhǎng)期保存，則需用含載體蛋白(如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA)的溶液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃。
如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)于一周，或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對(duì)細(xì)胞因子或重組蛋白進(jìn)行長(zhǎng)期保存。方法是：將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。
在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
即在做無(wú)血清培養(yǎng)或動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞因子中不能含有BSA，F(xiàn)BS或HSA等動(dòng)物或人的蛋白，要想長(zhǎng)期保存細(xì)胞因子或重組蛋白則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來(lái)稀釋已重懸的細(xì)胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。
